T7 RNA 聚合酶

2.7.7.6 ( BRENDA | IUBMB )

T7 RNA 聚合酶通常用于转录DNA，这些 DNA 已经克隆到具有两个相反方向的噬菌体启动子的载体中。可以使用不同的聚合酶，从插入 DNA 的任一链，选择性地合成 RNA。使用该系统可以产生同源标记的单链 RNA。转录物可以用生物素或 DIG-11-UTP 进行非放射性标记，或用 [α-³²P] 或 [α-³⁵S] 标记的核苷酸放射性标记至高比活性。

杂交探针的合成：T7 RNA 聚合酶能高效生产均一标记的 RNA。该标记的 RNA 可用作 Southern、Northern 和斑点印迹中的杂交探针，以及原位杂交。
合适的标记：转录物可以用生物素-16-UTP 或 DIG-11-UTP 进行非放射性标记。它们也可以用 [α-32P]- 或 [α-35S] 标记的核苷酸放射性标记为高比活性。

启动子特异性
T7 RNA 聚合酶具有极高的启动子特异性，仅转录噬菌体 T7 DNA 或克隆到T7 启动子下游的 DNA。尽管 T7 和 T3 启动子序列仅相差 3bp，但 T7 RNA 聚合酶仅转录克隆到其启动子下游的DNA。
热灭火：通过加入 2 μl 0.2MEDTA(pH8.0)和/或加热至 65℃ 来终止反应。

一个单位是在 + 37℃ 下，60 分钟内，在酸可沉淀的 RNA 产物中掺入 1nmol CMP的酶活性。

体积活性：≥20 U/μl

激活剂：T7 RNA 聚合酶被 BSA 或亚精胺强烈激活。

测试缓冲液
40mM Tris-HCl，pH 8.0(+ 20℃)，6mM MgCl 2，10mM 二硫苏糖醇，2mM 亚精胺，pH 约 8.0(+ 20℃)。
缺乏内切核酸酶
1。将 1 μg DNA 与 T7 RNA 聚合酶在 + 37℃ 下，在 25 μl 测试缓冲液中孵育 4 小时。显示没有 λDNA 降解的酶单位数 >100 U。
2。将 1 μg Eco RI/Hind III 片段的 λDNA 与 T7 RNA 聚合酶在 + 37℃ 下，在 25 μl 测试缓冲液中孵育 4 小时。显示条带图案没有改变的酶单位数 >100 U。
缺乏切割活性
1 μg pBR322DNA 与 T7 RNA 聚合酶，在 + 37℃ 下，在 25 μl 测试缓冲液中孵育 4 小时。显示没有松弛超螺旋结构的酶单位的数量 >100 U。
缺少 RNA 酶
4 μg MS2 RNA 与 T7 RNA 聚合酶，在 + 37℃ 下，在 50 μl 测试缓冲液中孵育 4 小时。显示没有 MS2 RNA 降解的酶单位数 >100 U。
转录实验中的性能
T7 RNA 聚合酶在 SP6/T7 转录试剂盒(目录编号 10 999 644 001)。使用Eco RI和50mCi [alpha-32P] CTP，[400 Ci/mmol(15 TBq/mmol)] 线性化的 0.5 μg pSPT19neo DNA 的标准测定中的掺入率，在20分钟内，产生 >50% 的输入放射性。
仅用于生命科学研究。不适用于诊断程序。
Roche 公司有 10x 浓缩 RNA 标记混合物，专为 DIG-或生物素标记而设计。这些混合物可以与 T7 RNA 聚合酶很好地联合使用。

组份不可单独销售
T7 RNA Polymerase, in buffer, pH 7.9 ≥20 U/μl
Transcription Buffer 10x concentrated

100

solution

Roche

dry ice

−20℃

1个试剂盒包含2个组分

GHS07

Warning

H319

P264 - P280 - P305 + P351 + P338 - P337 + P313

Eye Irrit. 2

12 - Non Combustible Liquids

WGK 2