Transcriptor高保真cDNA合成试剂盒

100

sufficient for 100 reactions
sufficient for 200 reactions
sufficient for 50 reactions

hotstart: no

Roche

pkg of 100 reactions (05091284001)
pkg of 200 reactions (05081963001)
pkg of 50 reactions (05081955001)

RT-PCR: suitable
RT-qPCR: suitable

purified RNA

probe-based

cDNA合成过程中常用的逆转录病毒逆转录酶与其他核酸分析实验技术使用的DNA聚合酶相比，往往具有更高的错误率。这会造成明显的碱基交换或移码，而这些错误会在后继PCR反应中被进一步放大。具有校正功能的高保真PCR酶已拥有很多年的历史；本次 Roche推出的全新高准确性逆转录酶能够进一步合成高产量全长cDNA。
高突变率是逆转录病毒复制的特点。该特点起源于病毒编码逆转录酶的基因组复制机制，该机制可以将病毒的基因组RNA转变为双链DNA。在这个逆转录过程中，发生复制错误的概率很高。一种目前可被接受的解释是逆转录酶缺少3'-5'外切酶活性，导致这种错误的发生。逆转录酶天然存在的高错误率使其无法在多种应用中表现出最佳性能。
Transcriptor高保真逆转录酶混合物，用于最长达到14 kb的RNA的高保真两步法RT-PCR。

Transcriptor高保真cDNA合成试剂盒的核心成分是Transcriptor高保真逆转录酶，该酶是一种混合物，含有经过基因重组的逆转录酶及具有校正调节功能的酶。两种酶的协同作用使其混合酶在逆转录RNA模板时可以获得比其他常用转录酶高7倍的保真度。
Transcriptor高保真逆转录酶混合物能有效逆转录长达14 kb的模板。该混合酶具有高热稳定性以及特别优化的缓冲体系，使整个逆转录过程可以在高达55℃的温度下进行。因此，无需添加任何附加成分，就可以解决具有复杂二级结构的高GC含量模板的逆转录问题，而这些附加成分可能会影响逆转录反应的准确性。

混合酶中的重组逆转录酶来自于大肠杆菌(E. coli)。该酶具有依赖于RNA的DNA聚合酶活性、依赖于DNA的DNA聚合酶活性、解旋活性及可降解RNA:DNA杂合体中RNA的RNase H酶活性。因此，在逆转录后，不再需要耗时的RNase H孵育步骤，从而缩短了反应时间并降低了实验成本。

Transcriptor高保真cDNA合成试剂盒提供了第一链cDNA合成反应过程中所需的所有试剂。该试剂盒支持三种不同引物系统的逆转录过程。该试剂盒提供了两种cDNA合成引物：随机六聚体引物和锚定oligo(dT)₁₈ 引物。其中，锚定oligo(dT)18引物可保证引物结合在poly(A) 尾的起始位置，有效避免引物结合在poly(A) 尾的中间位置，从而获得全长cDNA。长mRNA的5′ 端序列往往不完全，而锚定oligo(dT)18可保证获得全长cDNA，因此是大多数应用的首选。随机六聚体引物可结合在全长RNA上，在所有RNA序列上具有一致的性能，可用于逆转录不带有poly(A)尾结构的RNA。试剂盒还提供了具有热稳定性的保护RNA酶抑制剂(Protector RNase Inhibitor)，可保护RNA在高反应温度下不被降解。

Transcriptor高保真cDNA合成试剂盒专为RNA逆转录设计，比其他逆转录酶具有更高的保证度。该试剂盒采用Transcriptor高保真逆转录酶，该酶是由一种重组逆转录酶和一种具体校正调节功能的酶组成的混合物，通过针对两步RT-PCR法进行优化，使其成为以下应用的首选产品：

• 克隆目的基因。
• 转录组测序
• 生成含有大分子全长插入片段的cDNA文库
• 生成基因表达分析，如RNA剪接分析

由于该试剂盒还经过LightCycler^® 器和其他实时荧光定量PCR仪的测试，该产品也是需要高保真度的定量RT-PCR应用的理想选择。
该试剂盒包含合成cDNA所需的所有组分，适合直接用于在传统热循环仪中进行的定性RT-PCR或在实时荧光定量RT-PCR仪中进行的定量RT-PCR。50次反应包装还包含10次对照反应(对照RNA和对照引物混合物)。

Transcriptor高保真cDNA合成试剂盒包含以下组分：

• Transcriptor高保真逆转录酶(一种混合物，含有经过基因重组的逆转录酶及具有校正调节功能的酶)
• Transcriptor高保真反应缓冲液，5倍浓缩
• 保护RNA酶抑制剂(Protector RNase Inhibitor)
• dNTP混合液，PCR级
• 锚定oligo (dT)₁₈ 引物
• 随机六聚体引物
• DTT
• 水，PCR级
• 对照RNA - 来自于永生化细胞K-562的总RNA组分*
• 对照PBGD引物混合物(正向和反向引物)*

*仅在50次反应包装中提供。

每个批次的试剂盒均经过功能测试，即在测定中定量校正活性以及通过两步法qRT-PCR对K-562细胞总RNA中的PBGD mRNA进行定量。

逆转录酶概述
图4：使用Transcriptor高保真cDNA合成试剂盒比较不同孵育时间条件的转录效果。
在+50℃下，对1 μg的HeLa总RNA进行逆转录，孵育时间如图所示。取5 μl cDNA反应产物，用Roche的Expand Long Range dNTPack扩增8.5 kb片段。所有反应均重复两次
仅用于生命科学研究。不可用于诊断。
图1：Transcriptor高保真逆转录酶和常用M-MuLV逆转录酶的准确性比较。
使用Genome Sequencer 20 System测定逆转录酶的错误率。分别使用Transcriptor高保真逆转录酶和一种常用M-MuLV逆转录酶逆转录模板RNA。所得cDNA纯化后使用具有校正功能的聚合酶进行扩增，通过减去带有相同序列的质粒DNA对照PCR扩增中的错误率，计算得到逆转录酶的错误率。Transcriptor高保真逆转录酶的错误率是四次独立实验的平均值，每次实验至少对3.1 x 10⁶ 个碱基进行了测序。对于M-MuLV逆转录酶，对4.5 x 10⁶ 个碱基进行了测序。
准确度表示为错误率-1，即在发生单个转录错误之前成功逆转录的平均碱基数。Transcriptor高保真逆转录酶比标准M-MuLV逆转录酶具有更高的准确度，在cDNA合成过程中产生更低的错误率。
图2：比较不同逆转录酶对不同片段长度的总RNA的逆转录效果。
根据制造商的建议，使用不同的逆转录酶对总RNA(从1 μg的人肌肉总RNA中扩增2.3 kb片段；从1 μg的HeLa总RNA中扩增5.4 kb和9.4 kb片段；从2 μg的大鼠脑总RNA中扩增12.4 kb片段)进行逆转录。取5 μl cDNA反应产物，用Roche的Expand Long Range dNTPack产品进行扩增。结果显示，Transcriptor高保真cDNA合成试剂盒能够高效转录各种长度的片段，并且比其他品牌的逆转录酶具有更高的产量和特异性。
图3：使用Transcriptor高保真cDNA合成试剂盒比较不同孵育时间条件的转录效果。
在+50℃下，对1 μg的HeLa总RNA进行逆转录，孵育时间如图所示。取5 μL cDNA反应产物，用Roche的Expand Long Range dNTPack扩增8.5 kb片段。所有反应均重复两次。结果显示，Transcriptor高保真cDNA合成试剂盒能够以高速度和高准确度对RNA进行高效转录。。

LightCycler is a registered trademark of Roche

GHS07

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H319

P264 - P280 - P305 + P351 + P338 - P337 + P313

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