DPPH 自由基清除能力试剂盒

DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical)即 1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基。广泛用于定量测定生物试样和食品的抗氧化能力。

此法是根据 DPPH自由基有单电子，在 517nm处有一强吸收，其醇溶液呈紫色的特性。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，呈现的颜色越浅，即 A值越低，进而对样本中 DPPH清除能力进行定量分析。

试剂盒的组成和配制：

所需的仪器和用品：

酶标仪、96孔板、低温离心机、可调式移液器、研钵、冰、甲醇、无水乙醇和蒸馏水。

DPPH自由基清除能力测定：

建议正式实验前选取 2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！

1、样本制备：

①组织样本：

称取约 0.1g新鲜组织或者称取约 0.05g烘干样本(将样本在 105℃下杀青 3min，然后60℃烘干至恒重，粉碎，过 40目筛，得到烘干样本)，加入 1mL的 80%甲醇提取液(若鲜样需研磨均质)，于 60℃，200-300W条件下超声提取 30min(间隔 5min振荡混匀一次)，若有损失需用 80%甲醇定容至 1mL。12000rpm室温离心 10min，取上清测定。

【注】：若增加样本量，可按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为 1:5～10的比例进行提取

②细菌/细胞样本：

先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500万细菌或细胞加入 1mL80%甲醇提取液，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30次)；12000rpm室温离心 10min，取上清测定。

【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量(10⁴)：提取液(mL)为 500～1000:1的比例进行提取。

③液体样本：直接检测；若浑浊，离心后取上清检测。

2、上机检测：

①酶标仪预热 30min以上，调节波长至 517nm。

②不同样本清除能力不一，可先选取  2个样本做检测，若 A测定-A对照接近零，需对样本进行稀释(用 80%甲醇提取液稀释)后再检测，稀释倍数 D代入公式计算。

③在 EP管中依次加入：

【注】若一次性样本较多，可用排枪或者分批检测，以使测定管的反应时间(避光静置 30min)保持一致。

结果计算：

1、标准曲线：y =2.8486x + 0.7084；x是标准品 Trolox浓度(μg/mL)，y是清除率(%)。

2、DPPH自由基清除率(%)=［(1-(A测定-A对照)÷A空白)×100］%

3、定义：用从标准曲线上获得的抗氧化剂Trolox的量来表示样本的DPPH自由基清除能力。

4、按样本质量计算：

DPPH自由基清除能力(μg Trolox/g鲜重)=[(清除率-0.7084)÷2.8486×V₁]÷(V₁÷V×W) ×D=0.351×(清除率-0.7084)÷W×D

举例：若清除率是 70%，则用 70代入公式计算，即：

DPPH自由基清除能力(μg Trolox/g鲜重)=[(70-0.7084)÷2.8486×V₁]÷(V₁÷V×W) ×D

5、按细菌/细胞计算：

DPPH自由基清除能力(μg Trolox/10⁴ cell)=[(清除率-0.7084)÷2.8486×V₁]÷(V1÷V×500) ×D=0.0007×(清除率-0.7084)÷W×D

举例：若清除率是 70%，则用 70代入公式计算，即：

DPPH自由基清除能力(μg Trolox/g鲜重)=[(70-0.7084)÷2.8486×V₁]÷(V₁÷V×500) ×D

6、液体样本：

DPPH自由基清除能力(μg Trolox/mL)=[(清除率-0.7084)÷2.8486×V₁]÷V₁×D=0.351×(清除率-0.7084) ×D

举例：若清除率是 70%，则用 70代入公式计算，即：

DPPH自由基清除能力(μg Trolox/mL)=[(70-0.7084)÷2.8486×V₁]÷V₁×D

V----加入提取液体积，1 mL；          V₁----反应中样品体积，150μL=0.15 mL；

W----样品质量，g；                   Trolox分子量----250.29

附：标准曲线制作过程：

①制备标准品母液(0.5mg/mL)：临用前加 2mL甲醇，充分溶解混匀。

②把母液用甲醇稀释成以下浓度梯度的标准品：0,5,10,15,20, 25μg/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。

③按照测定管加样体系操作，依据结果即可制作标准曲线。