dsRNA(修饰)定量检测试剂盒(酶联免疫法)

预期用途

本试剂盒应用双抗体夹心酶联免疫法检测双链RNA(dsRNA)的残留。

检测原理

信使RNA (mRNA)是将DNA中编码的遗传信息传递给细胞的蛋白质合成机制的中间分子。由于现阶段mRNA技术的进步，包括对mRNA的修饰和对递送载体的改进，mRNA正在被探索作为各种治疗方法，例如，免疫肿瘤靶点药物、疫苗、蛋白质和基因编辑药物。该方法的简单性(即在体外合成类似于内源性mRNA并编码目的蛋白质的mRNA，然后在体外或体内递送和表达)使其具有广泛的适用性。

将体外转录的RNA用作预防或治疗需要大量具有低免疫原性的功能性mRNA，合成这些体外转录 mRNA主要是使用T7噬菌体RNA聚合酶(T7  RNAP)。T7  RNAP从包含特异性启动子的DNA模板中高效地转录RNA，但之前的研究已经确定了体外合成过程中某些会引发细胞免疫反应的副产物的存在，包括双链RNA (dsRNA)，这已被证明成为免疫通路的主要触发因素。

本试剂盒应用双抗体夹心酶联免疫法(夹心ELISA )检测体外转录体系或合成的mRNA原液中 dsRNA的含量。用捕获抗体包被微孔板，形成固相抗体，向固相抗体微孔板中加入dsRNA校准品和待测样品，然后加入检测抗体，最后加入辣根过氧化物酶标记的酶标试剂，形成“包被抗体-抗原-酶标检测抗体”复合物，经过洗涤后加入显色液显色，显色液在HRP酶的催化下转化成蓝色并在酸的作用下最终转换成黄色，颜色的深浅与样品中dsRNA的量呈正相关。

主要组成成分

说明：本试剂盒不可与其他商品化试剂盒混用。

需要但是未提供的试剂与耗材：

>去离子水或蒸馏水

>振荡器

>洗板机

>微量移液器与配套灭菌枪头

>恒温箱或水浴锅

>酶标仪

>加样槽

>吸水纸

>CB缓冲液(0.015 M Na2CO3，0.035 M NaHCO3，pH 9.6)

>封闭液(1%Casein，5%蔗糖，137 mM NaCl，2.7 mM KCl，8 mM Na2HPO4.12H2O，2 mM KH2PO4，PH 7.4)

储存条件及有效期

1、试剂盒于2 ～ 8℃储存，避免强光直射，有效期12个月。

2、包被条拆封使用后，应将剩余包被条密封，在2 ～ 8℃储存，在有效期内使用。

3、试剂盒其他组分使用后要及时放回到2 ～ 8℃条件，在有效期内使用。

4、本试剂盒应冷藏运输。

5、产品批号及失效日期：见产品外包装标签。

检验方法

1、酶标板制备

(1)1 ×包被工作液：将100 μl捕获抗体(100 ×)加入9.9 ml CB缓冲液中，上下颠倒混匀至少30次，制备成1 ×包被工作液，可根据实际用量增量10%配制。

(2)酶标板每孔加入100 μl 1 ×包被工作液。

(3)将酶标板水平置于4℃过夜包被。

(4)弃掉孔内液体，每孔至少加入300 μl 1 ×洗涤液，静置浸泡30 s，洗板1次，洗板完成后尽量去除残留液体。

(5)酶标板每孔加入180 μl封闭液，置于37℃封闭2 h。

2、实验前准备

(1)封闭好的酶标板弃掉孔板中的所有液体，确保孔中无液体残留。

(2)将试剂盒从冷藏环境中取出，放置室温(18 ～ 28℃)平衡至少30 min。

(3)1 ×洗涤液配制：将浓缩洗涤液(20 ×)用去离子水或蒸馏水20倍稀释，混匀备用。例如30 ml浓缩洗涤液(20 ×)用570 ml去离子水或蒸馏水稀释。

(4)校准品的配制：取校准品原液(300 ng/ml)稀释100倍后为校准品的第一个点(3 ng/ml)，再2倍倍比稀释成1.5、0.75、0.375、0.187、0.093、0.047  ng/ml。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新配制的校准品溶液。

▲由于实验室条件不同，标曲响应范围可能存在差异，可根据实验结果调整线性范围，保证标曲拟合大于6个点。若反应性偏高，可降低标曲首点浓度，反之则提高标曲首点浓度。

(5)1 ×检测抗体的配制：将检测抗体(100 ×)用样品稀释液稀释成1 ×检测抗体，根据检测数确定稀释体积(每孔100 μl)，例如检测整板，理论需要10 ml，实际配制11 ml 1 ×检测抗体，其他情况根据所需检测数理论用量，增量10%配制。

(6)1 ×酶标试剂的配制：将酶标试剂(100 ×)用酶标试剂稀释液稀释成1 ×酶标试剂，根据检测数确定稀释体积(每孔100 μl)，例如检测整板，理论需要10 ml，实际配制11 ml 1 ×酶标试剂，其他情况根据所需检测数理论用量，增量10%配制。

3、实验步骤

(1)加样：先在酶标板中每孔加入100 μl样品/校准品。

▲当不能够确定待测样品中的dsRNA含量时，应当用样品稀释液做多个稀释倍数做检测，以免含量过高不能够读取有效数值。

(2)孵育：用封板膜封板后，放入37℃恒温培养箱孵育1 h。

(3)洗板：孵育完成后，小心揭去封板膜，弃掉孔内液体，每孔至少加入300 μl 1 ×洗涤液，静置浸泡30 s，连续洗板4次，最后一次尽量去除残留液体。

(4)加检测抗体：以每孔100 μl加样量加入1 ×检测抗体。

(5)孵育：用封板膜封板后，放入37℃恒温培养箱孵育1 h。

(6)洗板：孵育完成后，小心揭去封板膜，弃掉孔内液体，每孔至少加入300 μl 1 ×洗涤液，静置浸泡30 s，连续洗板4次，最后一次尽量去除残留液体。

(7)加酶标试剂：以每孔100 μl加样量加入1 ×酶标试剂。

(8)孵育：用封板膜封板后，放入37℃恒温培养箱孵育1 h。

(9)洗板：孵育完成后，小心揭去封板膜，弃掉孔内液体，每孔至少加入300 μl 1 ×洗涤液，静置浸泡30 s，连续洗板4次，最后一次尽量去除残留液体。

(10)显色：按每孔100 μl将显色液加入酶标板，用封板膜封板后，放入37℃恒温培养箱避光孵育15 min。

(11)终止/读值：每孔加入50 μl终止液，轻轻混匀后即可用酶标仪检测各孔在450 nm单波长处OD值。

简明操作程序

质量控制

检测时，校准曲线相关系数R²≥0.99，否则实验无效。

结果计算

(1)校准品和样品孔测得的OD值扣除对照孔的OD值用于结果计算。

(2)以校准品的浓度取对数为横坐标，OD值为纵坐标，采用四参数方式拟合绘制校准曲线。如有设置复孔，则应取其平均值计算。

(3)将样品的OD值代入校准曲线的拟合方程式，计算出样品浓度，即为样品的实际浓度。最低定量限(LOQ)=47 pg/ml，低于47 pg/ml报告为<47 pg/ml。若样品OD值高于校准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。此校准曲线仅用于示范，每次实验均应生成新的校准曲线。

产品性能指标

1、灵敏度

2、精密度

3、回收率

注意事项

(1)操作前仔细阅读使用说明书，严格按照试剂盒说明书进行实验操作。

(2)避免在恶劣的环境(如含有84消毒液、次氯酸钠、酸碱或乙醛等高浓度腐蚀性气体及灰尘的环境)条件下进行实验，实验室消毒应在实验结束后进行。RNA酶Ⅲ和全能核酸酶能降解dsRNA，所以切勿在含有RNA酶Ⅲ以及全能核酸酶的环境中进行实验。

(3)试剂盒应平衡至室温下方可打开使用，试剂使用前应充分摇匀。各组分储存与用法请严格按照使用说明，切勿自行更改与稀释。在使用前，请严格检查试剂盒的效期与包装。如果效期超时或包装破损，请不要用于实验操作。试剂在有效期内使用后，剩余试剂要及时密封，参照说明书进行保存。

(4)预制酶标板可拆卸，每次将需用数量的板条取出后，其余未用板条须放回铝箔袋内于2 ～ 8℃储存待用。拆卸板条时，切勿碰触孔底，以免指纹或刮痕等影响之后的读值。洗板后，切勿放置太久避免酶标板干燥失活，需立即进行下一步操作。

(5)加样品时，避免产生气泡，避免枪头触及板底，造成刮痕影响读值。

(6)封板膜不可重复使用。不同批号的试剂组分不可混用，微量移液器枪头不可混用，以免交叉污染。

(7)若浓缩洗涤液出现结晶，应置于37℃中至溶解后再使用。洗涤时各孔需加满洗液，以防止孔口有残留试剂未被洗干净。洗涤要彻底。加液时不可用力过猛，避免串流。每次洗涤均应甩干孔内液体，最后应将孔内液体拍干(洗板推荐使用洗板机)。

(8)请在反应终止后15 min内进行。

(9)操作中须佩戴一次性手套和实验室规定的防护物品，检测后的废液和用具须按照当地政府和有关国家规定进行无害化处理。

(10)本产品仅供科学研究使用，不得用于临床医学诊断及其他非合理用途。