英文名称：

SPE-Ti-IMAC, 100%

中文名称：

固相萃取固定化亲和色谱微球

保存条件：

室温储存，保质期为五年。

适用范围：

本产品适用于对磷酸肽的鉴定和富集。

自备材料：

•样品：蛋白酶解液

注意：蛋白酶解液中不能含有干扰磷酸肽富集的物质，如 EDTA等络合剂、含磷酸根的缓冲盐！

•Loading buffer：80%ACN / 6%TFA水溶液

作用：将酶解液酸化，高浓度的 TFA-可以抑制酸性肽段的残留

•Wash buffer 1: 50%ACN / 6%TFA / 200 mM NaCl水溶液

作用：洗涤非特异性吸附的肽段，盐可以抑制非磷酸肽的残留。

•Wash buffer 2：30%ACN / 0.1%TFA水溶液

作用：洗涤残留的 Wash buffer1中的盐。

•Elution buffer：10%氨水溶液

•耗材：200 μL枪头、600 μl离心管、1.5 ml离心管、直径为 1 mm的筛板

•Tip柱准备：

(1)将 1 mm的筛板填入 200 μL枪头中，如图 1a-b所示，尽可能填的靠近枪头的底端。

图 1

(2)如图 2所示，将 600 μL离心管剪开，在离心管盖中间打孔，使 200 μL枪头可以卡在图 1c所示位置；

如图 2

(3)如图 1d所示，1 mL离心管剪掉盖子作为套管，然后在 200 μL的枪头中加入适量已螯合 Ti⁴⁺的 SPE-Ti-IMAC材料，Tip柱制作完成，如图 3所示。

如图 3

注意事项：

本产品 SPE-Ti-IMAC材料未螯合 Ti⁴⁺，首先应先将 Ti⁴⁺螯合到材料上，然后再进行磷酸肽富集。

200 μl枪头一般建议最多装 10 mg SPE-Ti-IMAC材料，如果样品起始量较大，请按比例增加 SPE-Ti-IMAC材料使用量。当材料使用量为 100 mg以下，可以使用柱管体积为 1 ml的 SPE柱管及其对应筛板；当材料用量为 100-200 mg时，可使用柱管体积为 3 ml左右的 SPE柱管及其对应筛板。

实验步骤：

一、 SPE-Ti-IMAC材料的 Ti⁴⁺螯合

1、按照 SPE-Ti-IMAC材料:硫酸钛 Ti(SO₄)₂ = 1:50 (m/m)，称取材料和硫酸钛。以称取 500 mg材料为例，将 25 g硫酸钛固体加入 50 mL平底离心管中，加入纯净水至 40 ml，超声溶解 (注意：硫酸钛在溶解过程中会放热，请缓慢加入)。向硫酸钛溶液中加入 SPE-Ti-IMAC材料，混匀，置于 Rolling Incubator上摇匀，室温过夜，请勿磁力搅拌。

注意：可按照实际制备情况酌情称取材料和硫酸钛，建议 SPE-Ti-IMAC材料不要低于 500mg。

2、次日，将步骤 1中的 SPE-Ti-IMAC材料静置至其完全沉到离心管底部，弃上清。

3、加入适量 0.1% TFA水溶液将 SPE-Ti-IMAC材料分散，混匀，静置至其完全沉到离心管底部，弃上清。

4、重复步骤 3，洗 5-6次左右，目的是尽量去除未螯合的 Ti⁴⁺。

5、加入 200 mM NaCl/0.1% TFA水溶液洗涤 SPE-Ti-IMAC材料 2次。

6、加入 0.1% TFA水溶液洗涤 2次，均匀转移至离心管中，可根据实验需求将 SPE-Ti-IMAC材料分散成不同的浓度(如 100 mg/ml或 10 mg/ml)，于 4℃保存。

7、检测 SPE-Ti-IMAC材料是否成功螯合 Ti⁴⁺：取 100 μL最后一次洗涤的上清液，加入 100 μL 30% H₂O₂(市售双氧水原液)中，若溶液不变色，说明螯合后的 SPE-Ti-IMAC材料已经洗干净。若溶液变色，则继续洗涤。同时，可取少量 SPE-Ti-IMAC材料，加入 100 μL 30% H₂O₂中，若材料呈现明显黄色，说明 Ti⁴⁺螯合的 SPE-Ti-IMAC材料制备成功，可用于后续磷酸肽富集。

注意：上述 3-6步骤为 SPE-Ti-IMAC材料的洗涤，主要目的是洗涤未螯合的 Ti⁴⁺，请勿省略。

二、Tip (SPE)法富集磷酸化肽

1、蛋白酶解液与 Loading buffer按体积比 1:1均匀混合，SPE-Ti-IMAC：蛋白酶解液= 20:1-30:1(m/m)均匀混合。以下以 250 μg蛋白酶解液，SPE-Ti-IMAC材料：蛋白酶解液=20:1为例。

注意：Loading buffer一定要足量，保证 TFA终浓度≥3%；因 SPE-Ti-IMAC材料在 Ti⁴⁺螯合过程中会略有损失，建议根据实验具体情况，自行优化材料与样品的使用比例，以达到最优使用效果！

2、向 5 mg Ti⁴⁺螯合的 SPE-Ti-IMAC Tip柱中加入 200 μL 0.1%TFA，清洗材料。

3、250 μL蛋白酶解液(1 μg/μL)与 Loading buffer按体积比 1:1充分混合，加入到 Tip柱中进行富集，总时间控制在 20 min左右。

4、加入 200 μL Wash buffer 1洗涤，除去非特异性吸附，重复 1次，总时间控制在 10 min左右。

5、加入 200 μL Wash buffer 2洗涤 1次，除去上述步骤中残留的盐，时间控制在 5 min左右。

6、加入 200 μL Elution buffer洗脱 2次，合并洗脱液，即富集好的磷酸肽，总时间控制在 15 min左右。

7、洗脱的样品在冻干机中冻干，于-20℃保存，质谱分析时需用 1% FA复溶。

注意：Tip法富集磷酸化肽一般通过离心的方式进行，一是为了更好的控制液体从 Tip中的流出速度(以上述 5 mg SPE-Ti-IMAC Tip柱为例，上样和洗脱的过程离心力一般控制在 80-100 g，洗涤过程控制在 200 g)，二是可以保证条件的一致，从而保证结果的重现性。上述 2-5步骤中的时间为离心时间。